cmv启动子的作用（cmv显示器）

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抽象

一般来说，转基因鸡是通过两种不同的程序生产的。第一个程序基于病毒转染系统。第二种程序，非病毒方法，基于直接转移到受体胚胎中的转基因胚胎细胞。

在本综述中，我们分析了转基因鸡生产中非病毒、基于细胞的策略中重要元素的有效性。

该策略的主要要素是：供体胚胎细胞的分离和培养;转基因构建;体外细胞转染;和嵌合体生产：将细胞注射到受体胚胎中，饲养和鉴定种系嵌合体，交配种系嵌合体，转基因遗传和转基因表达。

介绍：

转基因鸟类的生产受到卵子富含卵黄的结构及其独特的生殖系统的阻碍。直接DNA显微注射是哺乳动物中经常应用的技术，在鸟类中几乎是不可能的，因为母鸡的受精发生在生殖道的漏斗中，而鸟类的受精是多精子的（Perry 1987）。

此外，在多余的精子中鉴定雄性原核也很困难，卵子返回瘘管母鸡的输卵管也很困难。因此，转基因鸡通常通过两种不同的程序生产。

尽管病毒转染系统允许在鸡分裂和非分裂细胞以及鸡输卵管中有效引入和表达转基因，这种方法有一些重要的局限性。慢病毒载体有三个主要限制：

将载体基因组的大小限制在小于8至10 kb; 然而，在某些细胞中驱动特异性表达所需的启动子超过此大小;

载体插入可以通过插入诱变或邻近内源基因的反式激活导致内源性基因的破坏;

整合的慢病毒载体会受到位置效应的影响。此外，病毒转导技术的特点是胚胎致死率高，转基因鸡的种系传播和生产率相对较低且不可预测。

然而，慢病毒载体来源于慢病毒，慢病毒会导致人类和动物的慢性疾病，有时危及生命。

因此，在过去几年中，已经开发了一些替代策略，转基因鸡的产生已经尝试通过胚层细胞转移产生的嵌合中间体。然而，在这种情况下，原始生殖细胞（PGC）被提议作为将转基因引入鸡基因组的载体。

可以在输卵管中分泌大量蛋白质并且可以在 20-24 小时周期内定期产卵的母鸡是回收治疗性蛋白质的一种非常有吸引力的载体，因为鸡蛋的无菌内容物被包裹在硬壳中。

然而，在许多情况下，转基因方法在鸟类中的有效性仍然很低。在这篇综述中，我们分析了Web of Science数据库中引用的文献中非病毒的、基于细胞的转基因鸡生产策略的重要元素的有效性。非病毒、基于细胞的策略的主要要素是：

供体胚胎细胞的分离和培养;

转基因构建;

体外细胞转染;

嵌合体生产供体胚胎细胞的分离和培养

在基于非病毒细胞的方法中，PGC通常用于制造转基因鸡。与哺乳动物相比，鸟类PGC利用形成胚胎的循环系统从生发新月区域移动到未来的性腺。PGC独特的迁移特性为从以下细胞中鉴定/分离这些细胞提供了机会。

PGC可以根据某些形态特征进行鉴定，此外，为了鉴定PGC，使用以下方法：高碘酸-希夫（PAS）染色和针对PGC中存在的细胞表面糖蛋白的免疫学标志物。

由于从X期胚胎中分离出的PGC数量很少，这种细胞来源不是很受欢迎。第13-17阶段的血液成为产生鸡嵌合体的PGC的潜在来源。特别是来自第14阶段的血液似乎是最适合此目的的，因为循环PGC的浓度最高。

PGC已通过不同的纯化技术进行分离。然而，从胚胎血液中分离PGC的方法很复杂，并且导致获得的PGC数量非常少，这限制了这种分离方法用于技术更先进的转基因操作。

获得PGC的最实用方法似乎是将它们与5-7天大的胚胎的性腺分离。为此，在PBS[?]溶液中使用0.25%胰蛋白酶–0.01%EDTA对性腺进行片段化和/或消化。

与其他两种方法相比，简单方法：通过性腺（在50.37°C和8%CO2）来自缺乏钙和镁离子（PBS[?]）的PBS溶液中的7天龄胚胎。目前，这是从鸡胚胎性腺中分离PGC的最有效方法，因为它可以在短时间内收集大量高度纯化和活的PGC。

从一个胚胎中获得的PGC的数量是有限的，无论为了有效利用少量的PGC，必须通过体外培养细胞来增加数量。

PGC从胚胎血液中获得，并通过BRL条件的敲除DMEM与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和干细胞因子（SCF）补充在小鼠STO或水牛大鼠肝脏（BRL）饲养细胞上培养。PGC培养超过35天，并在转移到受体胚胎的血液中后成功迁移到生脊。

这些细胞也在受体性腺中分化为功能性配子。此外，使用小鼠成纤维细胞饲养细胞修改了PGC的培养系统，并生产了种系嵌合鸡，供体PGC的种系传播率超过95%。

这些培养系统使用异种动物细胞作为饲养细胞，使用该系统可能会增加动物病原体从其他动物细胞交叉转移的风险。与雄性PGC相比，女性PGC在该系统中的繁殖效率较低。

同样，该方法允许培养超过1年，细胞增殖和PGC原代培养物的冷冻库，尽管最初是从雄性和雌性胚胎中汇集的，但所有由此产生的细胞系似乎都没有雌性细胞。

相比之下雌性PGC在体外的长期培养成功，随后通过种系嵌合鸡产生了可存活的后代。在这种方法中，雌性PGC存在于培养超过90天的混合性别PGC群体中。此外，雌性PGC的最佳培养条件与雄性PGC不同。

关于长期PGC体外培养对细胞功能能力的影响知之甚少。因此，需要进一步的研究来支持鸡PGC培养的更高效率和通过体外长期培养抑制细胞分化。

转基因表达构建体

目的基因和/或标记基因，以及允许分离全长线性转基因片段的限制性位点。应考虑添加可能增加转基因表达水平的序列，检测转基因或其产物（即转基因蛋白上的表位标签）的策略也应该是构建体设计所固有的。

驱动基因表达的启动子/增强子元件具有一定的重要性，这取决于是否需要普遍存在或组织特异性表达。有几种已知的无处不在的启动子在广泛的细胞、组织和细胞周期中具有很强的活性。

巨细胞病毒即时早期基因启动子/增强子（CMV）在许多脊椎动物中是一种高效的启动子，但在鸡中，它似乎不如β-肌动蛋白有效。

许多基因仅在特定组织中表达或响应独特的环境信号，组织特异性转基因表达的可能性为鸟类的生物学研究和遗传操作开辟了新的途径。

最苛刻但也最受探索的领域是卵清蛋白基因的表达，鸡卵清蛋白启动子产生的卵清蛋白产量约占蛋清总蛋白的54%，是最强的组织特异性启动子之一。这种由雌激素诱导的表达机制仅在母鸡输卵管的肾小管腺细胞中发现。

鸡卵清蛋白启动子已被用于诱导转基因鸡生物反应器中治疗性蛋白质的输卵管特异性表达。卵清蛋白（Ov）基因含有许多调控元件，这些元件控制其转录活性并限制对禽输卵管的表达。

在鸡卵清蛋白启动子（OVA）的控制下构建特异性载体，并通过加强包括鸡输卵管特异性和增强子样（COSE）区域和ERE元件的序列。.

然而，与直接输卵管特异性表达的卵清蛋白基因相关的特定元件尚未完全确定，因此很难确定在鸡输卵管中提供治疗性蛋白质有效表达的最佳表达载体。

PGC的特点是诱导有效和持续转染的能力低。此外，这个过程有几个障碍，因为生殖细胞相对转录静止，并且容易关闭转基因表达。一般来说，PGC转染效率的评价集中在选择合适的细胞基因修饰方法及其评价体系上。

在将基因递送到PGC的非病毒系统中，电穿孔和脂质技术已被用于转移DNA。在脂质移植中，DNA被屏蔽并包装成几种不同的天然或合成化合物（载体），以促进细胞摄取和细胞内释放。这些载体试图在组装和细胞递送方面模仿病毒载体，但与病毒载体相比具有许多优势。

合成DNA载体对PGC的转染效率通常较低，并且在胚胎发育过程中转基因逐渐丢失。然而，当外源基因在发育的X阶段被引入鸡时，通过脂质化成功地转移到鸡PGC中已经实现了。

我们早期的体外和体内研究旨在比较不同鸡PGC（从循环血液或性腺中分离）纯化（ACK，Percoll或胰蛋白酶）和转染方法（电穿孔或脂质转染）对体外转基因表达和修饰供体细胞向受体性腺的迁移的影响。

转基因转染PGC的平均频率最高（75.8%）是通过Percoll密度梯度离心和电穿孔实现的。

一些作者最近提出使用转座子元件，以创建一种更通用的方法来靶向鸡种系干细胞。

转座子是可以在不同基因组位点之间重新定位的遗传元件，酶转座酶可以切除独特的DNA位点并将转座子重组为基因组中的靶位点转座子载体的使用将大大提高PGC稳定遗传修饰的效率。

迄今为止，已经提出了许多表达载体，并且已经建立了许多技术来创造转基因鸟类。为了实现这一目标，需要一种可靠的体外测定系统，用于验证输卵管中重组基因表达的效率。

可能是鸡输卵管上皮细胞（COEC）的培养，可以很容易地用基于输卵管特异性调控序列的构建体转染。

这种独特的，内部开发的COEC体外培养系统具有在体外产生治疗性蛋白质的潜力，这将允许验证它们的功能和活性，最重要的是，验证输卵管管中重组基因表达的效率。

嵌合体生产：

鸡嵌合体的形成涉及从供体胚胎中分离PGC，将细胞移植到受体胚胎中，以及随后的胚胎发育的常规程序。

将这些细胞注射到胚胎发育同一阶段的受体胚胎的胚下腔中。由此产生的公鸡具有功能性精子;然而，观察到种系嵌合鸡的百分比较低（1.9%）。

从2.5-3天大（13-17期）胚胎的血液中分离的PGC或5.5-6天大（26-28期）胚胎的性腺，可以通过蛋壳中打开的窗口注射到受体胚胎的背主动脉中。注射后，蛋壳可以密封，鸡蛋返回孵化器并孵化至孵化。

种系嵌合体的产生涉及将外源性PGC掺入受体胚胎的内源性性腺组织中。因此，PGC的两个群体，内源性和外源性之间存在特定的竞争，这导致产生两种类型的生殖细胞：来自供体的生殖细胞和来自受体的生殖细胞。

首先是生殖细胞诱导有丝分裂的能力，这取决于鸡的品种。调节宿主生殖细胞数量与人工引入细胞之比的第二个因素是到达性腺并定植它们的外源性PGC的数量，以及已经存在的内源性PGC的数量。

它们的相对比例可以通过灭菌部分或完全去除内源性PGC来增加。为了提高种系传播和遗传修饰的效率，已经开发了许多从受体胚胎中灭活和去除内源性PGC的方法。

其中一些方法在嵌合体的常规生产中是不切实际的，因为它们也会影响受体的胚胎发育。暴露于辐照联合PGC注射的胚胎的死亡率高于对照胚胎和暴露于辐照的胚胎。

供体PGC和受体PGC的性别很重要，因为与异性组合相比，供体PGC和受体胚胎的同性组合从种系嵌合鸡中衍生后代的频率显着更高。

关于操纵胚胎的孵化率、种系嵌合体的饲养和鉴定、交配种系嵌合体、转基因遗传和转基因表达的信息有限。

一些数据表明，种系嵌合体在卵巢和血浆中的性激素水平上表现出显着变化，这可能会影响它们的生殖能力。此外，嵌合体的育种通常不会导致转基因的种系传播。

在这种情况下从雄性PGC获得了可行的转基因后代，这些后代在绝育的受公鸡的成年睾丸中成熟。

结论：

非病毒、基于细胞的策略已用于转基因鸡的产生;然而，嵌合体生产、转基因遗传和转基因表达的效率仍然很低。因此，尽管这一策略表明转基因鸡可以在其输卵管中成功产生人道的治疗性蛋白质，但这种方法的广泛采用需要更多的信息。

胚胎干细胞与种系能力与转基因表达之间的关系仍然是一个开放的研究领域。

从这个角度来看，很明显，开发简单的PGC分离和基因改造方法，并将其转移到受体胚胎中，是生产转基因鸡的重要步骤。

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